Desarrollo de un dispositivo portátil de medición colorimétrica en el espacio de color RGB a partir de un nanooptodo reversible selectivo a iones potasio (ISO) basado en ionóforo valinomicina estabilizado con pluronic F-127 con aplicaciones a suelos agrícolas

Abstract

El potasio es un metal alcalino importante en varios campos de la investigación en áreas como la medioambiental, agrícola y clínica. El potasio es considerado un macroelemento involucrado en el correcto funcionamiento del cuerpo humano. Además, el potasio es un nutriente en los suelos agrícolas relacionado con la calidad de los suelos. La deficiencia de potasio en las plantas es causa de aproximadamente el 70 % de enfermedades en los cultivos. Actualmente, las técnicas de cuantificación de potasio en diferentes matrices se realizan por espectroscopia de plasma acoplado inductivamente (ICP) y absorción atómica (AA). Estas técnicas analíticas no son adecuadas para mediciones portátiles, debido a su complejidad, también se requiere pretratamiento ácido de las muestras, equipamiento y mantenimiento costoso. Este proyecto persigue el desarrollo de un nano-optodo selectivo y reversible a iones potasio (ISO) con posibilidad de usarlo en mediciones portátiles o in-situ. Este fue sintetizado por la miniaturización del bulk-optodo como núcleo de la micela y está recubierto con el surfactante y estabilizador de superficie Pluronic F-127, conformado por tres componentes activos como el ionóforo valinomicina, intercambiador de iones tetrakis (4- clorofenil) borato de potasio y el cromoionóforo ETH 5294 determinado como la fase orgánica del optodo. El nano-optodo es selectivo a iones potasio debido a la interacción estéricamente selectiva entre el ionóforo valinomicina y el ion potasio. La elevada selectividad es explicada por la estructura cíclica de la valinomicina con un espacio libre interno coincide con el diámetro iónico del potasio, la adición del cromoionóforo ETH 5294 con propiedades ópticas a diferentes valores de pH es capaz de producir una señal colorimétrica fácilmente medible. El mecanismo de reconocimiento del optodo se basa en la migración de iones potasio desde un medio acuoso a la fase sensora orgánica del optodo, produciendo la desprotonación del cromoionóforo ETH 5294 y la consecuente liberación de un ion hidrogeno, esto produce un cambio de color del optodo directamente proporcional a la concentración de potasio en solución. La síntesis del nano-optodo se realizó a partir de la miniaturización de su respectivo bulk-optodo, donde el proceso de miniaturización se hizo bajo condiciones de sonicación para generar nano micelas capaces de contener en su interior los componentes activos del optodo. Las ventajas de los nano-optodos sobre los bulk-optodos pueden resumirse en una fácil preparación, no requieren el uso de solventes orgánicos como THF y no son dependientes del pH del medio. Los bulk-optodos y nano-optodos se caracterizaron por técnicas de espectroscopia molecular UV-VIS, donde se estudió el cambio del color de la fase sensora según el perfil de desprotonación del cromoionóforo, obteniendo picos de absorción a longitudes de onda aproximados de 540 nm correspondiente a la absorción de la forma desprotonada del cromoionóforo ETH 5294 (C) y longitudes de onda aproximadas de 600 nm y 660 nm para la forma protonada del cromoionóforo ETH 5294 (C-H+) con un punto isosbéstico aproximado a 580 nm de los espectros a todas las concentraciones estudiadas. Los nano-optodos también se caracterizaron mediante técnicas de identificación estructural como el microscopio electrónico de barrido (SEM) permitiendo la descripción morfológica del nano-optodo, obteniendo formas esféricas coherentes con las micelas esperadas. Adicionalmente, se determinó el perfil de tamaños de los nano-optodos por la técnica de análisis de dispersión dinámica de la luz (DLS), donde se obtuvo tamaños de nano-optodos huecos promedios de 87.0 nm y 82.2 nm, con proporciones de 0.5 % y 1.0 % de surfactante pluronic F-127 respectivamente. Cuando se adicionó 20 μL de cocktail del optodo se obtuvo picos de tamaños de nano-optodos promedio de 412.4 nm y 181.7 nm a proporciones de 0.5 % y 1.0 % de surfactante pluronic F-127 respectivamente.

La optimización de los optodos incluyó el estudio de su composición y aditivos, así como la influencia a diferentes niveles de pH. Se obtuvo una concentración óptima para el bulk-optodo y nano-optodo de 2.40 μM tanto para el ionóforo valinomicina, intercambiador de iones tetrakis (4-clorofenil) borato de potasio y el cromoionóforo ETH 5294. En el bulk- optodo se evaluó la composición del soporte y relación de los aditivos como 160 mg del polímero PVC y 320 mg del plastificante DOS en una relación [1:2] y la estabilidad de la señal en un rango de pH entre valores de 5.0 y 9.0, obteniendo un valor óptimo al pH 7.00 del tampón TRIS a 20 mM. En el nano-optodo no se aplicó ningún soporte, en cambio, se usó al estabilizador de superficie Pluronic F-127 con una cantidad de 1.0 %. Los resultados optimizados mostraron una buena correlación con los perfiles de desprotonación teórico, estimados a partir de la composición, tanto del bulk-optodo como del nano-optodo. La validación analítica del bulk-optodo y nano-optodo se efectuó siguiendo las directrices del Instituto Nacional de Calidad (INACAL). Ambos optodos probaron ser altamente selectivos a iones K+, con una buena sensibilidad y precisión. Los iones interferentes (iones Na+, Li+, Ca2+ y Mg2+) obtuvieron coeficientes de selectividad mayores a 1.0, es decir, la interferencia en la concentración de potasio no es superior al 10 %. La sensibilidad analítica se determinó en el rango de trabajo para el modelo de calibración lineal del bulk-optodo desde 1.0 M - 10-6 M K+ con un LD BO = 0.31 μM (3.15 x 10-7 M) y para el nano-optodo desde 1.0 M - 10-4 M K+ con un LD NO = 30.3 μM (3.03 x 10-

5 M). La precisión fue verificada en condiciones de repetibilidad (mediciones realizas por el mismo analista) y condiciones de reproducibilidad (mediciones realizas por diferentes analistas). El parámetro estudiado fue la desviación estándar relativa (RSD), para el bulk- optodo solo a concentraciones altas de potasio (1.0 M), la desviación fue más alta que el RSDHorwitz, en cambio, para el nano-optodo, el RSD experimental fue menor al RSDHorwitz en todo el rango de potasio. La veracidad fue evaluada por comparación de los resultados de potasio de 4 muestras de suelos agrícola de la zona de Canta-Lima, provenientes de dos Fundos El Tambo y Tunapis en dos horizontes de 0-30 cm y 30-60 cm de profundidad. Estos resultados fueron comparados con las metodologías de referencias: Absorción Atómica (AA) y Electrodo selectivo a iones (ISE). En la prueba de ANOVA los valores de p-value fueron mayor a 0.05 (nivel de significancia del 95 %), por ende, la metodología aquí desarrollada se considera como veraz para el alcance propuesto como muestras acuosas de extracto de suelos agrícolas en un rango de trabajo de potasio entre 10-4 – 1.0 M. La estabilidad de la señal fue verificada por la trazabilidad de concentración de potasio para el bulk-optodo hasta 2 horas y nano-optodo hasta 48 horas. Para el bulk-optodo a concentraciones entre 10-6 M y 1.0 M de potasio fue estable entre 1 y 2 horas, la concentración fue disminuyendo por la pérdida de plastificante de la fase sensora. Para el nano-optodo la concentración fue estable por más tiempo, a concentraciones de 10-4 M, 10- 2 M y 1.0 M de potasio fue estable por 48 horas, 24 horas y 6 horas respectivamente. Después de optimizado el método de cuantificación de potasio por espectroscopia del UV-Vis, se utilizó esta metodología optimizada con un dispositivo de diseño propio de captura de imágenes para la detección del cambio de color del nano-optodo. El dispositivo usado es un ordenador de placa simple (SBC) Raspberry Pi 4 B capaz de convertir la imagen capturada con una cámara digital de 5 MP a una señal en el espacio de color RGB. A partir de las señales de color RGB se empleó una transformación logarítmica para obtener una correlación lineal entre el color de la fase sensora del nano-optodo y la concentración de potasio. El dispositivo de medición colorimétrica probó poca dependencia al control estricto de la iluminación externa, se comparó las pendientes e interceptos de las curvas de calibración de los distintos tipos de iluminación. Se obtuvieron valores semejantes de concentraciones de potasio en todo el rango de trabajo (10-5 – 10-1 M) para las luces de color blanca, rojo, verde, amarilla, azul y magenta, siendo poco precisa para iluminaciones de color rojo a concentración elevadas de potasio (10-1 M). Se compararon los resultados de la espectroscopia UV-Vis con los métodos de absorción atómica (AA) y electrodos selectivos de iones (ISE) en las muestras de extracción de iones de potasio del suelo. El análisis estadístico mostró que los resultados analíticos son estadísticamente semejantes para las tres metodologías estudiadas para suelos agrícolas, lo que confirma la fiabilidad del método colorimétrico. La sensibilidad, evaluada por el límite de detección (LD = 1,03x10-5) y el límite de cuantificación (LC = 3,42x10-5), es consistente con el rango de concentración propuesto (10-5 – 10-1 M K+). Este trabajo logró un novedoso hallazgo, con la reversibilidad del nano-optodo para reutilización analítica, esto se logró mediante la extracción de iones K+ dentro de la micela y posterior precipitación como sal insoluble tetrafenil borato de potasio (KTP4B), como lo demuestran las curvas de calibración durante un 1er y 2do ciclo de análisis, siendo equivalente entre sí. En resumen, esta tesis logró desarrollar un dispositivo colorimétrico basado en nano- optodos como sensor analítico y composición Raspberry pi con lenguaje de programación Python como una potente herramienta analítica para cuantificar iones K+. Se demostró que el nano-optodo es selectivo a iones potasio (K+), en presencia de iones interferentes estudiados (Na+, Li+, Ca2+ y Mg2+), también es altamente sensible y preciso, alcanzando límites de detección en el rango de 10-5 M y con variabilidad esperada según el RSD Horwitz. La veracidad de la metodología fue corroborada comparando con una metodología de referencia acreditada (AA). Adicionalmente el color desarrollado por el nano-optodo es estable hasta 48 horas y probó que la señal obtenida por el dispositivo colorimétrico es independiente de las condiciones de iluminación externa, demostrando el potencial de este dispositivo colorimétrico para un control ambiental preciso y rentable de iones K+ en suelos agrícolas.

Potassium is an important alkali metal in various fields of research in areas such as environmental, agricultural and clinical research. Potassium is considered a macroelement involved in the proper functioning of the human body. In addition, potassium is a nutrient in agricultural soils related to soil quality. Potassium deficiency in plants is the cause of approximately 70% of crop diseases. Currently, potassium quantification techniques in different matrices are performed by inductively coupled plasma spectroscopy (ICP) and atomic absorption (AA). These analytical techniques are not suitable for portable measurements, due to their complexity, also requiring acid pretreatment of the samples, expensive equipment and maintenance. This project pursues the development of a selective and reversible nano-optode to potassium ions (ISO) with the possibility of using it in portable or in-situ measurements. It was synthesized by the miniaturization of the bulk-optode as the micelle core and is coated with the surfactant and surface stabilizer Pluronic F-127, consisting of three active components such as the ionophore valinomycin, ion exchanger tetrakis(4-chlorophenyl) potassium borate and the chromium ionophore ETH 5294 determined as the organic phase of the optode. The nano-optodo is selective to potassium ions due to the sterically selective interaction between the valinomycin ionophore and the potassium ion. The high selectivity is explained by the cyclic structure of valinomycin with an internal free space coinciding with the ionic diameter of potassium, the addition of the chromium ionophore ETH 5294 with optical properties at different pH values is able to produce an easily measurable colorimetric signal. The optode recognition mechanism is based on the migration of potassium ions from an aqueous medium to the organic sensing phase of the optode, producing the deprotonation of the ETH 5294 chromionophore and the consequent release of a hydrogen ion, this produces a color change of the optode directly proportional to the concentration of potassium in solution. The synthesis of the nano-optode was performed from the miniaturization of its respective bulk-optode, where the miniaturization process was done under sonication conditions to generate nanomicelles capable of containing the active components of the optode. The advantages of nano-optodes over bulk-optodes can be summarized in easy preparation, they do not require the use of organic solvents such as THF and they are not dependent on the pH of the medium. The bulk-optodes and nano-optodes were characterized by UV-VIS molecular spectroscopy techniques, where the color change of the sensing phase was studied according to the deprotonation profile of the chromium ionophore, obtaining absorption peaks at wavelengths of approximately 540 nm corresponding to the absorption of the deprotonated form of the chromionophore ETH 5294 (C) and wavelengths of approximately 600 nm and 660 nm for the protonated form of the chromionophore ETH 5294 (C-H+) with an approximate isosbestic point at 580 nm of the spectra at all the concentrations studied. The nano-optodes were also characterized by structural identification techniques such as scanning electron microscopy (SEM) allowing the morphological description of the nano-optode, obtaining spherical shapes consistent with the expected micelles. Additionally, the size profile of the nano-optodes was determined by the dynamic light scattering (DLS) analysis technique, where average hollow nano-optode sizes of 87.0 nm and 82.2 nm were obtained, with proportions of 0.5 % and 1.0 % of pluronic surfactant F-127 respectively. When 20 μL of optode cocktail was added, average nano-optode size peaks of 412.4 nm and 181.7 nm were obtained at ratios of 0.5 % and 1.0 % pluronic F-127 surfactant, respectively.

Optimization of the optodes included the study of their composition and additives, as well as the influence at different pH levels. An optimum concentration for the bulk-optodo and nano-optodo of 2.40 μM was obtained for both the ionophore valinomycin, ion exchanger tetrakis(4-chlorophenyl) potassium borate and the chromium ionophore ETH 5294. In the bulk-optode, the composition of the support and ratio of the additives were evaluated as 160 mg of PVC polymer and 320 mg of DOS plasticizer in a [1:2] ratio and the stability of the signal in a pH range between values of 5.0 and 9.0, obtaining an optimum value at pH 7.00 of the TRIS buffer at 20 mM. In the nano-optode no support was applied, instead, the surface stabilizer Pluronic F-127 was used with an amount of 1.0 %. The optimized results showed a good correlation with the theoretical deprotonation profiles estimated from the composition of both the bulk-optode and the nano-optode. The analytical validation of the bulk-optode and nano-optode was performed following the guidelines of the National Institute of Quality (INACAL). Both optodes proved to be highly selective to K+ ions, with good sensitivity and precision. The interfering ions (Na+, Li+, Ca2+ and Mg2+ ions) obtained selectivity coefficients greater than 1.0, i.e., the interference in potassium concentration is not greater than 10 %. Analytical sensitivity was determined in the working range for the bulk-optode linear calibration model from 1.0 M - 10-6 M K+ with an LD BO = 0.31 μM (3.15 x 10-7 M) and for the nano-optode from 1.0 M - 10-4 M K+ with an LD NO = 30.3 μM (3.03 x 10-5 M). The precision was verified under repeatability conditions (measurements performed by the same analyst) and reproducibility conditions (measurements performed by different analysts). The parameter studied was the relative standard deviation (RSD), for the bulk-optode only at high potassium concentrations (1.0 M), the deviation was higher than the RSDHorwitz, on the other hand, for the nano-optode, the experimental RSD was lower than the RSDHorwitz in the whole potassium range. The trueness was evaluated by comparing the potassium results of 4 agricultural soil samples from the Canta-Lima area, coming from the two farms El Tambo and Tunapis in two horizons of 0-30 cm and 30-60 cm depth. These results were compared with the reference methodologies: Atomic Absorption (AA) and Ion Selective Electrode (ISE). In the ANOVA test the p-values were greater than 0.05 (95 % significance level), therefore, the methodology developed here is considered to be valid for the proposed scope as aqueous samples of agricultural soil extract in a working range of potassium between 10-4 - 1.0 M. Signal stability was verified by potassium concentration tracing for the bulk-optode up to 2 hours and nano-optode up to 48 hours. For the bulk-optodo at concentrations between 10-6 M and 1.0 M potassium was stable between 1 and 2 hours, the concentration was decreasing due to the loss of plasticizer from the sensing phase. For the nano-optode the concentration was stable for a longer time, at concentrations of 10-4 M, 10-2 M and 1.0 M potassium it was stable for 48 hours, 24 hours and 6 hours respectively. After optimizing the potassium quantification method by UV-Vis spectroscopy, this optimized methodology was used with a self-designed image capture device for the detection of the color change of the nano-optode. The device used is a Raspberry Pi 4 B single board computer (SBC) capable of converting the image captured with a 5 MP digital camera to a signal in the RGB color space. From the RGB color signals, a logarithmic transformation was employed to obtain a linear correlation between the color of the sensing phase of the nano-optode and the potassium concentration. The colorimetric measurement device proved little dependence on the strict control of external illumination, the slopes and intercepts of the calibration curves for the different types of illumination were compared. Similar values of potassium concentrations were obtained over the whole working range (10-5 - 10-1 M) for white, red, green-, yellow-, blue-

and magenta-colored lights, being inaccurate for red illuminations at high potassium concentration (10-1 M). UV-Vis spectroscopy results were compared with atomic absorption (AA) and ion selective electrode (ISE) methods on soil potassium ion extraction samples. Statistical analysis showed that the analytical results are statistically similar for the three methodologies studied for agricultural soils, confirming the reliability of the colorimetric method. The sensitivity, evaluated by the limit of detection (LOD = 1.03x10-5) and the limit of quantification (LOQ = 3.42 x10-5), is consistent with the proposed concentration range (10-5 - 10-1 M K+). This work achieved a novel finding, with the reversibility of the nano- optode for analytical reuse, this was achieved by the extraction of K+ ions within the micelle and subsequent precipitation as insoluble potassium tetraphenyl borate salt (KTP4B), as demonstrated by the calibration curves during a 1st and 2nd cycle of analysis, being equivalent to each other. In summary, this thesis succeeded in developing a colorimetric device based on nano- optodes as an analytical sensor and Raspberry pi composition with Python programming language as a powerful analytical tool to quantify K+ ions. It was demonstrated that the nano- optode is selective to potassium ions (K+), in the presence of studied interfering ions (Na+, Li+, Ca2+ and Mg2+), it is also highly sensitive and accurate, reaching detection limits in the range of 10-5 M and with expected variability according to the RSD Horwitz. The veracity of the methodology was corroborated by comparison with an accredited reference methodology (AA). Additionally, the color developed by the nano-optode is stable up to 48 hours and proved that the signal obtained by the colorimetric device is independent of external illumination conditions, demonstrating the potential of this colorimetric device for accurate and cost-effective environmental monitoring of K+ ions in agricultural soils.